การ วัดปริมาณโปรตีนตามสีของ สเปกโตรโฟโตมิคเมทิ คัล
โปรตีนมักเป็นส่วนผสมของโปรตีน การตรวจวัดด้วยโทนสีจะขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของโปรตีนคือกรดอะมิโน (เช่น tyrosine, serine) ทำปฏิกิริยากับกลุ่มโครเมียมเพิ่มเติมหรือสีย้อมเพื่อผลิตวัสดุสี ความเข้มข้นของวัสดุสีจะสัมพันธ์โดยตรงกับจำนวนกรดอะมิโนที่โปรตีนทำปฏิกิริยาจึงสะท้อนความเข้มข้นของโปรตีน
วิธี Colorimetric
มีหลายวิธีเช่น BCA, Bradford และ Lowry
วิธี Lowry: ขึ้นอยู่กับปฏิกิริยา Biuret ที่เร็วและปรับปรุง โปรตีนทำปฏิกิริยากับ Cu2 เพื่อให้เกิดปฏิกิริยาสีฟ้า อย่างไรก็ตามวิธี Lowry มีความไวกว่า Biuret ข้อเสียคือความจำเป็นที่จะต้องเพิ่มน้ำยาต่างๆหลายชนิด ปฏิกิริยาใช้เวลานาน; อ่อนแอต่อสารที่ไม่ใช่โปรตีน โปรตีนที่มี EDTA, Triton x-100 และแอมโมเนียซัลเฟตไม่เหมาะสำหรับวิธีนี้
Bicinchoniinine acid assay: เป็นการทดสอบโปรตีนใหม่ที่มีความไวสูงกว่า โปรตีนที่ได้รับการวิเคราะห์จะทำปฏิกิริยากับ Cu2 ในสารละลายอัลคาไลน์เพื่อผลิต Cu ซึ่งก่อให้เกิด chelate กับ BCA เพื่อสร้างสารประกอบสีม่วงที่มีจุดสูงสุดในการดูดซับที่ 562 นาโนเมตร ความสัมพันธเชิงเส้นระหวางความเขมขนของสารประกอบนี้และโปรตีนมีความแข็งแรงและสารประกอบที่เกิดขึ้นหลังจากปฏิกิริยามีความเสถียรมาก เมื่อเทียบกับวิธี Lowry การทำงานจะง่ายและความไวสูง อย่างไรก็ตามวิธีการของโลว์รีย์คล้ายคลึงกับวิธี Lowry ก็จะไวต่อการแทรกแซงโปรตีนและผงซักฟอก
วิธีแบรดฟอร์ด: หลักการของวิธีนี้คือโปรตีนทำปฏิกิริยากับ Coomassie Brilliant Blue เพื่อผลิตสารประกอบสีที่ดูดซับที่ 595 นาโนเมตร คุณลักษณะที่ยิ่งใหญ่ที่สุดของมันคือความไวซึ่งเป็น 2 เท่าของ Lowry และ BCA มันง่ายและเร็วขึ้น ต้องใช้สารปฏิกิริยาเพียงชนิดเดียวเท่านั้น สารประกอบสามารถคงที่เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้ง่ายขึ้น การแทรกแซง Lowry BCA ทำปฏิกิริยากับสารลด (เช่น DTT, mercaptoethanol) เข้ากันได้ อย่างไรก็ตามยังคงมีความไวต่อผงซักฟอก ข้อเสียเปรียบหลักคือมาตรฐานที่แตกต่างกันสามารถนำไปสู่ความแตกต่างอย่างมากในผลลัพธ์ของตัวอย่างเดียวกันและไม่มีผลที่เท่ากัน
นักวิจัยบางคนที่ได้รับการตรวจวัดค่าสีเป็นครั้งแรกอาจสับสนกับผลลัพธ์ของการทดสอบสีต่างๆ คุณคิดว่าวิธีการใดที่คุณสับสน? เนื่องจากกลุ่มที่ทำปฏิกิริยาต่างกันและกลุ่มที่มีโครโมโซมไม่เหมือนกันหลายวิธีจึงถูกนำมาใช้พร้อม ๆ กันเพื่อทำให้ความเข้มข้นตัวอย่างของตัวอย่างเดียวกันไม่สอดคล้องกัน ตัวอย่างเช่น Keller et al. ทดสอบโปรตีนในนมของมนุษย์และพบว่าความเข้มข้นที่วัดโดย Lowry และ BCA สูงกว่าของ Bradford อย่างมีนัยสำคัญ แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าจะกำหนดตัวอย่างเดียวกันตัวอย่างมาตรฐานที่เลือกโดยวิธี colorimetric เดียวกันจะไม่สอดคล้องกันและความเข้มข้นหลังจากการทดสอบยังไม่สอดคล้องกัน ยกตัวอย่างเช่นใช้ Lowry เพื่อทดสอบโปรตีนในเนื้อเยื่อของเซลล์โดยใช้ BSA เป็นมาตรฐานมีความเข้มข้น 1.34 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรและ globulin เป็นมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 2.64 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ดังนั้นก่อนที่จะเลือกวิธี colorimetric ควรอ้างอิงส่วนประกอบทางเคมีของตัวอย่างที่จะทดสอบและหาค่ามาตรฐานทางเคมีที่คล้ายกันเป็นมาตรฐาน นอกจากนี้วิธีการ colorimetric สำหรับ quantifying โปรตีนมักจะทำให้เกิดปัญหาในการที่ค่าการดูดกลืนของตัวอย่างต่ำเกินไปส่งผลให้ความแตกต่างระหว่างความเข้มข้นของตัวอย่างที่วัดได้และความเข้มข้นที่เกิดขึ้นจริง ประเด็นสำคัญคือสีของส่วนที่สำคัญของเครื่องฟอกสปีดโฟลิก 1011 ซึ่งเป็น Cuvette มีครึ่งชีวิตครึ่งหนึ่งดังนั้นวิธี Colorimetric แต่ละอันจะแสดงเวลาการทดสอบปฏิกิริยา ตัวอย่างทั้งหมด (รวมทั้งตัวอย่างมาตรฐาน) ต้องผ่านการทดสอบในช่วงเวลานี้ ถ้าเวลายาวเกินไปค่าการดูดกลืนที่ได้จะน้อยลงและค่าความเข้มข้นที่แปลงแล้วจะลดลง นอกจากนี้อุณหภูมิของปฏิกิริยาค่าความเป็นกรด - ด่างของสารละลาย ฯลฯ เป็นปัจจัยสำคัญทั้งหมดที่มีผลต่อการทดลอง นอกจากนี้การใช้ colorimetry พลาสติกเป็นสิ่งสำคัญมาก หลีกเลี่ยงการใช้ Cuvettes ที่ทำจากผลึกหรือแก้วเพราะสีหลังจากเกิดปฏิกิริยาจะทำให้ผลึกหรือแก้วเป็นสีทำให้เกิดการดูดกลืนที่ไม่ถูกต้องของตัวอย่าง
บริษัท เชี่ยวชาญการขาย spectrophotometers ยินดีต้อนรับลูกค้าที่มีความต้องการปรึกษาและซื้อเราจะให้คุณด้วยบริการจริงใจและคุณภาพผลิตภัณฑ์ตลอดจนราคาที่ต่ำกว่า
E-mail: info@sumerlab.com
เว็บ: sumerinstrument.com