เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์กลายเป็นเครื่องมือประจำในห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาสมัยใหม่ มักใช้สำหรับกรดนิวคลีอิกปริมาณโปรตีนและปริมาณของความเข้มข้นการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย
หลักการง่ายๆของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์
สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ใช้แหล่งกำเนิดแสงที่สามารถสร้างความยาวคลื่นหลายช่วงและผ่านชุดอุปกรณ์สเปกโทรสโกปีเพื่อสร้างแหล่งกำเนิดแสงของความยาวคลื่นเฉพาะ หลังจากที่แหล่งกำเนิดแสงผ่านตัวอย่างที่จะทดสอบแล้วส่วนหนึ่งของแหล่งกำเนิดแสงจะถูกดูดซับและจะคำนวณการดูดกลืนแสงของตัวอย่างดังนั้นจึงแปลงเป็นความเข้มข้นของตัวอย่าง . การดูดกลืนแสงของตัวอย่างเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของตัวอย่าง
ปริมาณของกรดนิวคลีอิก
ปริมาณของกรดนิวคลีอิกเป็นฟังก์ชั่นที่ใช้บ่อยที่สุดของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Oligonucleotides, DNA แบบควั่นเดี่ยว, เกลียวคู่และ RNA สามารถวัดปริมาณได้ในบัฟเฟอร์ จุดสูงสุดของการดูดซึมสูงสุดของการดูดซึมสูงสุดของกรดนิวคลีอิกคือ 260 นาโนเมตร องค์ประกอบระดับโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกแต่ละชนิดมีความแตกต่างกันดังนั้นปัจจัยการแปลงจะแตกต่างกัน ในการหาปริมาณนิวคลีอิกชนิดต่าง ๆ ให้เลือกค่าสัมประสิทธิ์ที่สอดคล้องกันล่วงหน้า ตัวอย่างเช่นการดูดกลืนแสงของ 1 OD สอดคล้องกับ 50 μg / ml ของ dsDNA, 37 μg / ml ของ ssDNA, 40 μg / ml ของ RNA และ 30 μg / ml ของ Olig การดูดซับหลังการทดสอบจะถูกแปลงโดยค่าสัมประสิทธิ์ข้างต้นเพื่อให้ได้ความเข้มข้นตัวอย่างที่สอดคล้องกัน ก่อนการทดสอบให้เลือกขั้นตอนที่ถูกต้องป้อนปริมาณของโซลูชันสินค้าคงคลังและเจือจางจากนั้นทดสอบวิธีแก้ปัญหาเปล่าและตัวอย่าง อย่างไรก็ตามการทดสอบนั้นไม่ราบรื่นเสมอไป การอ่านที่ไม่เสถียรอาจเป็นอาการปวดหัวที่ใหญ่ที่สุดสำหรับผู้ทดสอบ เครื่องมือที่มีความไวสูงแสดงการดูดซับที่ดีกว่า
ในความเป็นจริงหลักการออกแบบและหลักการทำงานของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ช่วยให้ค่าการดูดกลืนแสงแตกต่างกันในช่วงหนึ่งนั่นคือเครื่องมือมีความแม่นยำและแม่นยำ ตัวอย่างเช่นความแม่นยำของ Eppendorf Biophotometer คือ≤1.0% (1A) ผลของการทดสอบหลายครั้งนั้นแตกต่างกันไประหว่างประมาณ 1.0% ของค่าเฉลี่ยและเป็นปกติ นอกจากนี้ยังจำเป็นที่จะต้องพิจารณาคุณสมบัติทางเคมีกายภาพของกรดนิวคลีอิกและค่าความเป็นกรดด่างของบัฟเฟอร์ซึ่งกรดนิวคลีอิกนั้นถูกละลายความเข้มข้นของไอออน ฯลฯ : เมื่อความเข้มข้นของไอออนสูงเกินไปในระหว่างการทดสอบ การอ่านค่ากะดังนั้นจึงแนะนำให้ใช้ค่า pH ที่แน่นอนและความเข้มข้นของไอออนต่ำ บัฟเฟอร์เช่น TE ทำให้การอ่านคงที่อย่างมาก ความเข้มข้นของการเจือจางของตัวอย่างเป็นปัจจัยที่ไม่สามารถเพิกเฉยได้เนื่องจากการมีอยู่ของอนุภาคละเอียดบางชนิดโดยเฉพาะอย่างยิ่งตัวอย่างกรดนิวคลีอิกในตัวอย่าง การปรากฏตัวของอนุภาคขนาดเล็กเหล่านี้รบกวนผลการทดสอบ เพื่อลดผลกระทบของอนุภาคที่มีต่อผลการทดสอบการดูดซับของกรดนิวคลีอิกจะต้องมีอย่างน้อยมากกว่า 0.1 A และการดูดกลืนแสงควรอยู่ระหว่าง 0.1 ถึง 1.5 A ภายในช่วงนี้การรบกวนของ อนุภาคมีขนาดค่อนข้างเล็กและผลลัพธ์มีเสถียรภาพ
ซึ่งหมายความว่าความเข้มข้นของตัวอย่างไม่ควรต่ำหรือสูงเกินไป (เกินช่วงทดสอบของเครื่องวัดแสง) ในที่สุดปัจจัยการดำเนินงานเช่นการผสมควรเพียงพอมิฉะนั้นค่าการดูดกลืนแสงต่ำเกินไปแม้แต่ค่าลบ ส่วนผสมนั้นไม่มีฟองสบู่เหลวไม่มีสารแขวนลอยมิฉะนั้นการอ่านจะลอยอย่างรุนแรง cuvette เดียวกันจะต้องใช้ในการทดสอบว่างเปล่าและตัวอย่างมิฉะนั้นความแตกต่างในความเข้มข้นมีขนาดใหญ่เกินไป; ปัจจัยการแปลงและหน่วยความเข้มข้นของตัวอย่างจะถูกเลือกอย่างสม่ำเสมอ ไม่สามารถใช้ cuvette พร้อมกับการสึกหรอของหน้าต่าง ปริมาตรของตัวอย่างจะต้องถึงปริมาตรต่ำสุดที่ cuvette ต้องการ
นอกเหนือจากความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกสเปคโตรโฟโตมิเตอร์ยังแสดงอัตราส่วนที่สำคัญหลายอย่างที่บ่งบอกถึงความบริสุทธิ์ของตัวอย่างเช่นอัตราส่วนของ A 260 / A 280 ที่ใช้ในการประเมินความบริสุทธิ์ของตัวอย่างเนื่องจากการดูดซึมสูงสุดของโปรตีน 280 นาโนเมตร ตัวอย่างบริสุทธิ์ที่มีอัตราส่วนมากกว่า 1.8 (DNA) หรือ 2.0 (RNA) หากอัตราส่วนต่ำกว่า 1.8 หรือ 2.0 แสดงว่ามีโปรตีนหรือสารฟีนอลิก 230 แสดงว่ามีสารปนเปื้อนบางอย่างอยู่ในตัวอย่างเช่นคาร์โบไฮเดรตเปปไทด์ฟีนอล ฯลฯ และอัตราส่วนของกรดนิวคลีอิกที่บริสุทธิ์ 260 / A 230 มากกว่า 2.0 320 ตรวจจับความขุ่นของสารละลายและปัจจัยรบกวนอื่น ๆ สำหรับตัวอย่างที่บริสุทธิ์ A 320 นั้นเป็น 0 โดยทั่วไป
หางโจวสุเมเรียนตราสาร จำกัด
เพิ่ม: No.168 Wuchang Ave. , Yuhang District, Hangzhou 310023, China
โทร: + 86-571-88739859
โทรศัพท์: +8618658504900
อีเมล: info@sumerlab.com
เว็บ: sumerinstrument.com