หลักการและการประยุกต์ใช้ส่วนประกอบทั่วไปของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เบื้องต้น

Spectrophotometer ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยทางชีววิทยาเคมีคลินิกและสิ่งแวดล้อม
Spectrophotometry วัดปริมาณแสงที่สารเคมีสามารถดูดซับได้โดยผ่านลำแสงผ่านตัวอย่างในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์
โดยการวัดความเข้มของแสงที่ตรวจพบสามารถใช้วิธีนี้เพื่อกำหนดความเข้มข้นของตัวถูกละลายในตัวอย่าง
แนวคิดของ Spectrophotometry
ลำแสงที่ส่งไปยังตัวอย่างประกอบด้วยลำแสงโฟตอน
เมื่อโฟตอนตอบสนองโมเลกุลในตัวอย่างโมเลกุลสามารถดูดซับบางส่วนลดจำนวนโฟตอนในลำแสงและลดความเข้มของสัญญาณตรวจจับ
การส่งผ่านเป็นส่วนหนึ่งของแสงผ่านตัวอย่าง มันถูกกำหนดให้เป็นความเข้มของแสงผ่านตัวอย่างที่ความเข้มของแสงที่ตกกระทบ
ค่าการดูดกลืนแสงจะตรงข้ามกับการส่งผ่านซึ่งสอดคล้องกับปริมาณที่วัดได้ด้วยเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์
ตามการดูดกลืนแสงความเข้มข้นของสารตัวอย่างสามารถหาได้จากกฎหมายของแลมเบิร์ตซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างการดูดกลืนกับความเข้มข้นของตัวอย่าง ตามกฎหมายเบียร์แลมเบิร์ตค่าการดูดกลืนแสงเป็นผลมาจากค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงซึ่งเป็นตัวชี้วัดปริมาณแสงที่ถูกดูดกลืนโดยตัวถูกละลายที่ความยาวคลื่นที่กำหนดและระยะทางที่แสงผ่าน ตัวอย่างหรือระยะทางในการเดินทางและละลายความเข้มข้น โดยทั่วไปจุดประสงค์ของการวัดค่าการดูดกลืนแสงคือการวัดความเข้มข้นของตัวอย่าง
ส่วนประกอบของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์
สเปกโทรโฟโตมิเตอร์แต่ละเครื่องประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสงคอลลิเลเตอร์ (เลนส์หรืออุปกรณ์การโฟกัสสำหรับการส่งลำแสงที่แรงและเป็นแนวตรง) โมโนโครมสำหรับแยกลำแสงที่มีความยาวคลื่นต่างกันและตัวเลือกความยาวสำหรับเลือกคลื่นหรือร่องของความยาวคลื่นที่ต้องการ ความยาวคลื่นของแสงที่ใช้ในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่นำเสนอในวิดีโอนี้อยู่ในช่วงของแสงอุลตร้าไวโอเลตและแสงที่มองเห็นได้ สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ยังมีตัวยึดตัวอย่างเครื่องตรวจจับแสงและหน้าจอที่แสดงผลลัพธ์ของเครื่องตรวจจับ
spectrophotometer ล่าสุดเป็นคู่โดยตรงกับคอมพิวเตอร์ที่สามารถควบคุมพารามิเตอร์การทดลองและผลลัพธ์ที่ปรากฏ
หลักการทำงานของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์
เมื่อดำเนินการสเปกโทรโฟโตเมทรีเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องใช้ความระมัดระวังอย่างเหมาะสมเช่นสวมถุงมือทั้งนี้ขึ้นอยู่กับประเภทของสารละลายชีวภาพหรือสารเคมีที่คุณใช้
เปิดอุปกรณ์และปล่อยให้หลอดไฟและอุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์ร้อนก่อนที่จะวัดสเปกตรัม UV-Vis ของตัวอย่าง
เตรียมตัวอย่างเปล่า ๆ ของสารละลายเดียวกันที่มีค่า pH เท่ากันและความแข็งแรงของไอออนิกที่คล้ายกัน แต่ไม่มีส่วนประกอบที่ต้องวิเคราะห์ เนื่องจาก cuvette และตัวทำละลายสามารถกระจายแสงได้จึงจำเป็นต้องวิเคราะห์ตัวอย่าง
ตัวยึดตัวอย่างสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบดั้งเดิมออกแบบมาเพื่อยึดชามพลาสติกและควอตซ์ ปิเปตสารละลายดั้งเดิมลงในชาม
หลังจากเช็ดลายนิ้วมือและสาดที่ด้านนอกของชามใส่ cuvette เข้าไปในตัวยึดตัวอย่างอย่างถูกต้องและปิดประตูฝา
อย่าลืมปิดประตูเพราะรังสี UV จากเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์แบบเปิดสามารถทำลายดวงตาและผิวหนังของคุณได้
ตั้งโปรแกรมความยาวคลื่นที่ต้องการหรือช่วงความยาวคลื่นที่จะถูกส่งไปยังตัวอย่าง ขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นที่ดีที่สุดที่องค์ประกอบที่วิเคราะห์สามารถดูดซับได้ เครื่องจะถูกทำให้เป็นศูนย์โดยการวัดตัวอย่างเปล่าซึ่งจะทำการลบค่าการดูดกลืนแสงด้านล่างเนื่องจากบัฟเฟอร์ตัวอย่าง
อาจจำเป็นต้องสร้างเส้นโค้งมาตรฐานก่อนการวัดตัวอย่างซึ่งสามารถกำหนดความเข้มข้นของสารประกอบที่วิเคราะห์ในตัวอย่างได้ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับประเภทของการทดลองสเปกโทรโฟโตเมทรี
ปล่อยให้ตัวอย่างไปถึงอุณหภูมิที่เหมาะสมและผสมเบา ๆ เพื่อหลีกเลี่ยงการแนะนำฟอง จากนั้นสามารถเพิ่มตัวอย่างลงในชามโดยตรงภายในเครื่องและสามารถอ่านค่าได้
หลังจากวัดตัวอย่างสำหรับการดูดกลืนแสงแล้วการทดสอบจะได้รับการคำนวณอย่างเหมาะสม ตัวอย่างเช่นเพื่อกำหนดระดับความเข้มข้นหรือกิจกรรมของเอนไซม์
แอพลิเคชันของสเปกโทรโฟโตมิเตอร์
หนึ่งในการใช้งานทั่วไปของ spectrophotometer คือการวัดความหนาแน่นของเซลล์ การวัดความหนาแน่นของเซลล์สามารถใช้ในการสร้างเส้นโค้งการเติบโตแบบลอการิทึมของแบคทีเรียซึ่งสามารถกำหนดเวลาที่เหมาะสมสำหรับการรวมโปรตีน recombinant
สเปกโตรโฟโตมิเตอร์สามารถใช้เพื่อวัดอัตราการเกิดปฏิกิริยาเคมี ในศูนย์รวมนี้การดูดกลืนแสงจะใช้ในการตรวจสอบปฏิกิริยาของเอนไซม์ซึ่งหายไปกับเวลาผ่านปฏิกิริยาระดับกลางที่ 452nm อัตราของขั้นตอนของเอนไซม์นี้สามารถคำนวณได้โดยการจับคู่ข้อมูลกับสมการที่เหมาะสม
การนำไมโครสเปคโตรโฟโตมิเตอร์ช่วยลดความต้องการของตัวยึดตัวอย่าง เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เหล่านี้ใช้แรงตึงผิวเพื่อรักษาตัวอย่าง
Microspectrophotometer เป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดในการวัดมวลและความเข้มข้นของตัวอย่างขนาดเล็กและราคาแพงเช่นชีวโมเลกุลรวมถึงโปรตีนและกรดนิวคลีอิก
การดูดซับของโปรตีนที่ 280nm นั้นขึ้นอยู่กับเนื้อหาของโซ่ด้านอะโรมาติกที่พบในทริปโตเฟนไทโรซีนและฟีนิลอะลานีนรวมถึงพันธะซัลไฟด์ระหว่างสองซีสเตอีน
ความเข้มข้นของโปรตีนสามารถพิจารณาได้จากการดูดซับที่ 280nm และค่าสัมประสิทธิ์การดูดซับซึ่งขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของกรดอะมิโน
DNA และ RNA มีค่าการดูดกลืนแสงสูงสุดที่ 260nm ซึ่งสามารถหาค่าความเข้มข้นได้ ความบริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกยังสามารถประเมินได้จากอัตราส่วนการอ่านค่าการดูดกลืนแสงต่อความยาวคลื่นเฉพาะ